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题目： 基于网络药理学和代谢组学探究银耳多糖复方对酒精性脂肪肝大鼠的保护机制
作者： 陈俊峰，林悦暖，黄雨婷，郎永花，张宇霖，郑明锋
网络首发日期： 2026-06-11
引用格式： 陈俊峰，林悦暖，黄雨婷，郎永花，张宇霖，郑明锋．基于网络药理学和代 谢组学探究银耳多糖复方对酒精性脂肪肝大鼠的保护机制[J/OL]．中国酿造. https://link.cnki.net/urlid/11.1818.TS.20260610.1916.006
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基于网络药理学和代谢组学探究银耳多糖复方对酒精性脂肪肝大鼠的保护机制
陈俊峰，林悦暖，黄雨婷，郎永花，张宇霖，郑明锋*
（福建农林大学 食品科学学院 福建 福州 350002）
摘要：基于网络药理学的方法筛选出银耳多糖复方（Tremella fuciformis polysaccharideformulation，TFPF）活性成分及靶点，获取其与酒精性脂肪肝（AFLD）的交集靶点，构建药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝网络图，利用 STRING 数据库进行蛋白互作网络分析，并通过 DAVID 平台进行基因本体论（GO）和京都基因与基因百科全书（KEGG）通路富集分析；同时采用二锅头灌胃建立 AFLD 大鼠模型，同时给予 TFPF 干预 4 周，检测血清血脂、肝脏氧化应激指标及肝功能标志物，观察肝脏病理变化；采用非靶向代谢组学分析差异代谢物及其富集通路。结果表明，PIK3CA、PIK3R1、LCK、MAPK3、AKT1、MAPK1、STAT3、JAK2、IL2、SRC10 为关键靶点，主要富集于色氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及TNF信号通路等通路上。动物实验显示，TFPF高剂量组可显著减轻肝脏脂肪化，改善肝细胞肿胀及脂肪空泡坏死；并使血清 TC、TG、LDL-C 降低，HDL-C 升高；肝组织SOD、GSH 水平升高，MDA 及 ALT、AST 降低。代谢组学结果显示，吲哚丙酮酸、田蓟苷、根皮素等为主要差异代谢物，富集于色氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及癌症中的中心碳代谢通路。由此可知 TFPF 可通过调节脂质代谢及减轻氧化应激缓解酒精性脂肪肝，其作用机制可能与 MAPK3、PIK3R1、MAPK1 等靶点及色氨酸等氨基酸代谢通路密切相关，为开发安全有效的天然功能性食品及多靶点干预酒精性肝损伤提供了重要理论依据和实验基础。
关键词：银耳多糖复方；酒精性脂肪肝；网络药理学；代谢组学；氧化应激中图分类号：R284 R575.5
基金项目：中央引导地方科技发展专项（2021L3007)
作者简介：陈俊峰（2000-），男，硕士研究生，研究方向为药食同源物质对于酒精性肝、脑的保护作用 E-mail：1692081899@qq.com
*通信作者：郑明锋（1967-），男，副教授，博士，研究方向食品功能性成分的研究与开发；E-mail：vanzheng@163.com
酒精性脂肪肝（Alcoholic fatty liver disease, AFLD）是作为酒精性肝病（Alcoholic liverdisease，ALD）的初始阶段，是因长期过量摄入酒精所引发的肝脏脂质代谢紊乱性疾病[1]。全球约有 4.8%的成年人受酒精相关肝病影响，男性的患病率明显高于女性，这一疾病负担随着全球酒精消费和饮酒年限的增长而持续上升[2]。根据研究数据统计，全球范围内每年因酒精相关性肝病导致的死亡人数逾 300 万[3-4]。酒精性脂肪肝不及时干预可进一步进展为酒精性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化，严重者可发展为肝功能衰竭或肝细胞癌[5]。
目前，AFLD 的防治仍以戒酒为核心，早期干预可部分逆转肝损伤，但患者长期戒酒依从性较低。营养支持（如补充维生素、蛋白质及ω-3 脂肪酸）可改善肝细胞代谢与修复功能[6]。药物治疗方面，糖皮质激素虽可改善重症酒精性肝炎患者的短期预后，但长期应用不良反应明显[7]。此外，靶向肠道菌群及表观遗传调控（如 HDAC 抑制剂）的干预策略显示出潜在价值，但仍处于探索阶段[8-9]。因此，开发安全、有效且具有多靶点调控作用的干预手段，已成为 AFLD 研究的重点方向。
药食同源食品原料因其多靶点、低毒性的特点备受关注。银耳多糖、铁皮石斛、葛根、枳椇子、姜黄、甘草等食品或中药材及其活性成分在改善酒精性肝损伤方面的研究已取得了显著的进展。多种中药及其活性成分可通过调节脂质代谢、抑制炎症反应、改善氧化应激及维护肠道微生态稳态等多途径发挥保护作用[10]。银耳多糖（Tremella fuciformis Polysaccharide，TFP）作为本课题组前期从银耳中分离纯化的活性物质，已有研究表明能通过激活 Nrf2/HO-1抗氧化通路，增强肝脏抗氧化防御，减轻酒精诱导的氧化应激损伤[11]；铁皮石斛能通过调控 AMPK 信号通路改善脂质代谢紊乱，抑制肝内脂质沉积[12]；葛根素能通过抑制 CYP2E1介导的乙醇代谢氧化应激，减少活性氧生成[13]；枳椇子能通过增强 ADH 和 ALDH 活性，促进乙醇及乙醛代谢清除，缓解酒精引起的肝损伤[14]；姜黄素能通过抑制 NF-κB 炎症信号通路减轻肝脏炎症反应[15]；甘草也能通过抑制 HMGB1/TLR4 信号通路，缓解炎症及肝细胞损伤[16]。然而，现有研究对多种药食同源物质复配组成复合配方去缓解酒精性肝损伤具体效果、作用机制系统阐释方面仍存在不足，需进一步深入研究。
因此，本研究通过银耳多糖、铁皮石斛、葛根、枳椇子、姜黄、甘草构建银耳多糖复方（TFPF），通过网络药理学预测，并构建动物模型通过代谢组学分析方法研究银耳多糖复方对酒精性脂肪肝的保护效果及潜在机制，为开发天然功能性食品预防和改善酒精性脂肪肝提供试验依据与理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
银耳多糖（TFP）：本课题组前期分离纯化所得，数均分子量(Mn)、峰位分子量(Mp)、重均分子量(Mw)分别为 5080658Da、4862728Da、5199002Da；银耳多糖复方（TFPF）：葛根、铁皮石斛、枳椇子、甘草、姜黄等中药材均购自揭西县译佰大药房有限公司。实验动物为 6 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠，体重 200-210 g，由福州吴氏实验中心实验室提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2024-0003，动物实验遵循《福建农林大学实验动物关爱与使用伦理指南》。水飞蓟素胶囊来源德国 MADAUSGMBH 有限公司，TC、TG、MDA、SOD、GSH、ALT、AST 试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SpectraMax i3x 多功能酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司；RM2016 病理切片机：上海徕卡仪器有限公司；JB-P5 包埋机：武汉俊杰电子有限公司；Vanquish 液相色谱仪：赛默飞世尔科技公司；Q Exactive 质谱仪：赛默飞世尔科技公司；MB-96 组织研磨器：浙江美壁仪器有限公司；E200MV 生物显微镜：尼康株式会社。
1.3 方法
1.3.1 复方制备
参照最新版《保健食品检验与评价技术规范》中酒精性肝损伤模型的检验方法，设定银耳多糖复方（TFPF）低、中、高三剂量组。中剂量按各组分的人体推荐量计算，低剂量为中剂量 50%，高剂量为中剂量 2 倍。制备步骤如下：采用精密天平按配方准确称取银耳多糖及葛根、铁皮石斛等组分，按料液比 1:25（w/v）用去离子水浸泡 60 min 后，先武火煮沸30 min 再文火煎煮 60 min；随后加入 8 倍体积去离子水再次煎煮 60 min，合并两次提取液并过滤，得到 TFPF 原液（总料液比 1:33）。高剂量组（TFPFH）：浓缩至 10.52 g/mL，按人体推荐量 12 倍给药，剂量 10 mL/kg·bw。中剂量组（TFPFM）：浓缩至 5.26 g/mL，按人体推荐量 6 倍给药，剂量 10 mL/kg·bw。低剂量组（TFPFL）：稀释至 2.63 g/mL，按人体推荐量 3 倍给药，剂量 10 mL/kg·bw。
1.3.2. 复方活性成分筛选与靶点预测
采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（https://www.tcmsp-e.com）对银耳多糖复方中的甘草、葛根、铁皮石斛、枳椇子及姜黄进行活性成分筛选。检索时在“herb name”选项下输入各药材名称，并设置口服生物利用度（oral bioavailability, OB）>30%和类药性（drug-likeness, DL）>0.18 作为筛选标准[17]，以获取各药材的潜在活性成分及其对应靶点。对于在 TCMSP 中未收录靶点信息的活性成分，通过 PubChem 数据库检索其分子结构并获取SMILES表达式。随后将SMILES导入SwissTargetPrediction平台以预测其潜在作用靶点。在银耳多糖靶点筛选过程中，鉴于其为结构复杂的大分子多糖，难以直接通过现有数据库获取完整成分信息，本研究参考已发表的中英文文献，对其单糖组成进行系统归纳，主要包括葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖及鼠李糖等，将其对应的（SMILES）输入 SwissTargetPrediction 平台进行靶点预测。
1.3.3 酒精性脂肪肝靶点预测及其与活性成分交集靶点获取
在 Gene Cards database 数据库（https://www.genecards.org/）中检索关键词“AFLD”，设定筛选阈值为 relevance score≥9 的靶点，以筛选与疾病关联性较强的靶点；在 OMIM 数据库（https://www.omim.org）中搜索“AFLD”收集对应的酒精性脂肪肝靶点，在两个网站收集的疾病靶点，将三个数据库中获得的靶点数据整理合并去重，得到疾病靶点集合，利用微生信在线绘图软件绘制活性成分与疾病交集靶点的韦恩图。
1.3.4 药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝网络图的构建
使用 Cytoscape_v3.8.0 软件，构建“药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝”网络图，将 获 取 复 方 活 性 成 分 靶 点 和 交 集 靶 点 按 要 求 依 次 导 入 Cytoscape 软 件 中 ， 采 用Cytoscape-Analyzer 插件分析各活性成分的节点连接度（Degree）值，并按照节点大小 Degree来调节网络图分布。
1.3.5 PPI 蛋白互作网络构建
将疾病-活性成分交集靶点导入 STRING 数据库（https：//string-db.org），设置筛选条 件（物种：Homo sapiens；最低相互作用评分：0.9）获取 PPI 网络并下载数据，随后在 Cytoscape 中进行可视化，并利用 CytoNCA 插件对 Degree 计算并通过两轮筛选得到关键靶点。
1.3.6 GO 功能及 KEGG 通路富集分析
将交集靶点列表导入 DAVID 数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/）的“Gene List Manager”模块，并选择物种为 Homo sapiens。在“Functional Annotation”工具中分别选择 BP、CC 和 MF 进行 GO 功能富集分析，同时选择“KEGG_PATHWAY”进行 KEGG 通路富 集分析，并下载相关结果文件。随后利用 R 语言对 GO 和 KEGG 的富集结果进行可视化处 理。GO 富集结果根据 P value 由小到大排序，分别选取 BP、CC 与 MF 中排名前十的显著 通路进行展示；KEGG 通路富集同样按照 Pvalue 排序，并选取排名前二十的通路进行可视 化分析。
1.3.7 动物实验分组及给药方法
本研究将大鼠分笼饲养于清洁、通风的环境中，温度维持在 25±2 ℃，光暗周期为 12 h/12 h，自由取食饮水。适应性饲养 1 周后，随机分为 6 组（每组 n=10）：空白对照组、模 型组、阳性对照组及银耳多糖复方低、中、高剂量组（TFPFL、TFPFM、TFPFH）。实验 期间，每日上午 9:00 对银耳多糖复方剂量组给予对应剂量干预，阳性对照组给予水飞蓟素 溶液干预（10 mL/kg），空白对照组及模型组给予等量生理盐水。下午 15:00，除空白对照 组外，其余各组以 10 mL/kg·bw（实际乙醇摄入量为 4.48 g/kg）56°二锅头灌胃建立酒精性 脂肪肝模型[18]。实验周期为 30 天，给药剂量按人体等效剂量换算，并根据体重每周调整。 依据《药理实验方法学》，换算系数 W=0.018，成人体重按 60 kg，大鼠体重按 0.45 kg 计算 人与大鼠体表面积等效剂量的换算公式[19]：
1.3.8 生理生化指标测定
实验结束后按《福建农林大学实验动物关爱与使用伦理指南》处死大鼠，心脏处取血， 全血静置 30 min，4 ℃、4000 r/min 离心 10 min 分离血清，按试剂盒检测 TC、TG、HDL-C 及 LDL-C。取肝组织称量后按 1∶9（w/v）加入预冷生理盐水制成匀浆，4 ℃、2500 r/min 离心 10 min 取上清，于-80 ℃保存备用。采用南京建成试剂盒测定氧化应激指标（SOD、 GSH、MDA）及肝功能指标（ALT、AST）
1.3.9 组织形态学分析
完整剖取大鼠肝脏，PBS 清洗后取左小叶约 1/4，以 4%PFA 固定于无菌离心管中。石 蜡切片依次经脱蜡剂 A、B 各 20 min 脱蜡，梯度乙醇（100%A/B 各 5 min、75%5 min）脱 水后，流水冲洗。冰冻切片于-20℃平衡后以 4%PFA 固定 15 min，并以蒸馏水冲洗。经预处 理液孵育 1 min 后，置改良苏木精染 3~5 min，流水冲洗并经酸性分化液、碱性返蓝液处理。 随后以伊红染液染色 15 s，并进行梯度脱水与透明处理（无水乙醇Ⅰ-Ⅲ、正丁醇Ⅰ-Ⅱ、二甲苯 Ⅰ-Ⅱ），最终封片于中性树胶，最后用光学显微镜进行观察拍照。
1.3.10 肝脏代谢组学分析
取-80 ℃保存的肝脏组织于 4 ℃条件下缓慢解冻，混匀 1 min。称取约 50 mg 组织，加 入 400 μL 预冷甲醇提取液，涡旋震荡 1 min 充分破碎。样品于 4 ℃、12000 r/min 离心 10 min， 取上清液于 EP 管中，在真空离心浓缩仪中浓缩干燥。残渣以 150 μL 含 4 ppm 2-氯-L-苯丙 氨酸的 80%甲醇溶液复溶，经滤膜过滤后转入 LC-MS 进样瓶待测[20]。
色谱条件：采用 Thermo Vanquish UPLC 系统，配 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速 0.3 mL/min，柱温 40 ℃，进样量 2 μL。正离子模式下，流 动相为 A2：0.1%甲酸水，B2：0.1%甲酸乙腈，梯度：0~1min，10%B2；1~5 min，10%→ 98% B2；5~6.5 min，98%B2；6.5~6.6 min，98%→10%B2；6.6~8 min，10%B2。负离子模 式下，流动相为 A3：5 mM 甲酸铵水，B3：乙腈，梯度：0~1 min，10%B3；1~5 min，10% →98% B3；5~6.5 min，98%B3；6.5~6.6 min，98%→10%B3；6.6~8 min，10%B3。
质谱条件：质谱分析采用 Thermo Q Exactive（ESI 源），正负离子模式同时采集。ESI⁺/ESI⁻ 喷雾电压分别为 3.50 kV 和-2.50 kV，鞘气 40 arb、辅助气 10 arb，毛细管温度 325℃。一级 全扫描分辨率 70000，扫描范围 m/z 100-1000；采用 HCD（30 eV）进行二级碎裂，二级分 辨率 17500，选取前 10 个特征离子进行 MS/MS，并启用动态排除以减少冗余碎片信息。
2. 结果与分析
2.1 复方活性成分筛选与靶点预测
通过 TCMSP 数据库得到银耳多糖含有活性成分 7 种，甘草含有活性成分 92 种，葛根含有 24 种活性成分，铁皮石斛含有 11 种活性成分，姜黄含有 3 种活性成分，枳椇子共含有7 种活性成份。在 TCMSP 与 swiss target prediction 中共收集到活性成分的预测靶点共 4001个，银耳多糖、甘草、葛根、铁皮石斛、枳椇子、姜黄中预测靶点分别为 38、564、126、208、113、360 个，将所得的靶点合并去重后得到 728 个靶点。
2.2 酒精性脂肪肝靶点预测及其与活性成分交集靶点获取
结合 GeneCards 数据库和 OMIM 数据库获得酒精性脂肪肝靶点 2736 个。随后将疾病相关靶点与银耳多糖复方的药物作用靶点进行交集分析，并绘制韦恩图以展示潜在共同靶点。由图 2-1 可知，在酒精性脂肪肝中共鉴定出 386 个交集靶点，占复方药物靶点的 53.0%，占疾病靶点总量的 14.1%。
图 2-1 银耳多糖复方-酒精性脂肪肝交集靶点韦恩图
Figure 2-1 Venn diagram of overlapping targets between the compound TFPF and alcoholic fatty
liver disease
2.3 药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝网络图
根据疾病靶点与复方活性成分的相互作用，采用 Cytoscape v3.8.0 软件构建“药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝”网络，如图 2-3 所示为药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝网络图；图 2-2 共有 416 个节点，712 条边。其中度值排名前三的为槲皮素、山柰酚、豆甾醇，分别为 191、101、73。研究表明，槲皮素可通过抑 TLR4/IRAK4/NF-κB 信号通路活性来抑制 AR 大鼠炎症反应[21]。山柰酚通过调节 IL-6/STAT3 信号通路缓解妊娠糖尿病大鼠机体炎症反应，同时改善胰岛 β 细胞功能，降低血糖和血脂水平，减轻氧化应激损伤，维持代谢稳态[22]。研究表明，豆甾醇（β-Sitosterol）可通过上调 Nrf2 表达并促进其核转位，激活 HO-1、NQO1 等下游抗氧化通路，增强 ROS 清除能力，从而抑制氧化应激损伤并发挥保护作用[23]。
图 2-2 药物-活性成分-交集靶点-酒精性脂肪肝网络图
Figure 2-2 Drug-active ingredient-intersecting target-alcoholic liver injury network diagram
2.4 PPI 蛋白互作网络构建
通过 String 数据库得到 PPI 网络图相关的数据并利用 Cytoscape-APPs-CytoNCA 筛选关键靶点并可视化。结果如表 2-3 所示，酒精性脂肪肝相关的关键靶点共 10 个；图 2-3 PPI网络图。图中圆圈越大、颜色越深、线条越粗，表明度值越大、靶点作用越强，外圈颜色最深的圈即为上表所展示的核心靶点，关键靶点共十个，分别为 PIK3CA、PIK3R1、LCK、MAPK3、AKT1、MAPK1、STAT3、JAK2、IL2、SRC。研究表明，PIK3CA、PIK3R1、AKT1、和 SRC 主要参与 PI3K-AKT 信号通路，从而调控脂质代谢稳态，抑制脂肪生成并促进脂肪酸β-氧化[24]；同时，MAPK1 和 MAPK3（ERK1/2）介导的 MAPK 通路在氧化应激和炎症反应中发挥关键作用[25]；JAK2、STAT3、IL2 及 LCK 所涉及的 JAK-STAT 通路则进一步调控免疫炎症反应[26]。
图 2-3 活性成分-酒精性脂肪肝交集靶点 PPI 网络图
Figure 2-3 PPI network diagram of active components-alcoholic liver injury intersection targets
2.5 GO 功能及 KEGG 通路富集分析
由图 2-4 可知，银耳多糖复方缓解酒精性肝损伤在分子层面（MF）可能通过调节蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、激酶调节活性等物质分子功能（CC）活性发挥作用；细胞功能方面，通过对膜筏、膜微域等细胞内成分起作用；生物过程（BP）方面，通过对需氧刺激响应、信号释放转运等生物途径来对酒精性脑损伤进行缓解。由图 2-5 可知，银耳多糖复方缓解酒精性肝损伤可能涉及的通路有：色氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、PI3K-Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等。这些通路均与氧化应激、氨基酸代谢、炎症反应相关，表明 TFPF 对酒精性脂肪肝的保护可能通过这些途径完成。
图 2-4 银耳多糖复方缓解酒精性脂肪肝作用靶点的 GO 分析
Figure 2-4 GO Analysis of targets for TFPF alleviating alcoholic liver injury
图 2-5 银耳多糖复方缓解酒精性脂肪肝作用靶点的 KEGG 分析
Figure 2-5 KEGG analysis of targets for TFPF alleviating alcoholic liver injury
2.6 生理生化指标
血清血脂水平与体内脂质代谢密切相关，其中 TC、TG、LDL-C 和 HDL-C 是评价脂质 代谢状态的重要指标。研究表明，这些指标异常可导致肝细胞脂质沉积、氧化应激增强及炎 症反应激活，从而共同促进酒精性脂肪肝（AFLD）的发生和发展[27]。如图 2-6（A-D）所 示，与 Control 组相比，Model 组血清 TG、LDL-C 水平极显著升高（p<0.01），TC 水平显 著升高（p<0.05），而 HDL-C 水平极显著降低（p<0.01），表明酒精摄入导致大鼠脂质代 谢明显紊乱。与 Model 组相比，阳性对照组及 TFPF 各剂量组的 TC、TG、LDL-C 水平均显 著下降（p<0.05 或 p<0.01），HDL-C 水平显著升高（p<0.05 或 p<0.01）。其中 TFPFH 组 改善效果最为显著，其血脂水平更接近 Control 组，提示高剂量 TFPF 对酒精诱导的脂质代 谢紊乱具有最强的改善作用。
ALT 和 AST 是肝脏细胞中的非特异性功能酶，两者水平的变化反映了肝细胞膜完整性 及线粒体功能状态的改变[28-29]。由图 2-6（E-F）可知，与 Control 组相比，Model 组肝脏 ALT、 AST 水平极显著升高（p<0.01），提示酒精已造成大鼠肝细胞损伤。与 Model 组相比，Positive Control 组及 TFPF 各剂量组的肝脏 ALT、AST 水平均极显著降低（p<0.01），且 TFPFM 组 降低幅度最大，接近 Control 组水平。酒精代谢过程中产生的乙醛及过量活性氧（ROS）可 诱导线粒体功能障碍和脂质过氧化反应，破坏肝细胞膜结构，导致转氨酶外泄，从而使 ALT 和 AST 水平显著升高，所以 Model 组肝脏 ALT、AST 水平极显著升高。而在 TFPF 干预后， 各剂量组 ALT 和 AST 水平极显著下降，提示其对肝细胞具有良好的保护作用。
图 2-6 银耳多糖复方对各组大鼠血清生化指标及肝功能指标的影响
Figure 2-6 Effect of TFPF compound on serum biochemical indexes and liver function indexes of rats in each group
注：A：总胆固醇 TC； B：甘油三酯 TG； C：低密度脂蛋白 LDL-C； D：高密度脂蛋白 HDL-C；E：丙氨酸氨基转移酶 ALT；F：天门冬氨酸氨基转移酶 AST。 与 Model 组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）；与 Control 组相比，#表示差异显著（p<0.05），##表示差异极显著（p<0.01）。
MDA 是一种对机体有害的脂质过氧化产物，它在机体组织中的水平异常变化反应了自 由基对组织细胞的损伤程度[24]；SOD、GSH 作为机体中主要的两种抗氧化酶，两者活性水 平升高不仅能清除机体自由基，而且在一定程度上能降低 MDA 含量。如图 2-7（A–C）所 示，Model 组肝脏中 SOD、GSH 含量较 Control 组显著下降（p<0.01），提示氧化应激增强。 与 Model 组相比，TFPFH 组肝脏 MDA 显著降低（p<0.01），SOD 显著升高（p<0.05）， Liver AST (et Sram L-coвн VEPE.M TEPFEN Lher ALT (gpret Scran ) 13 T TFPE NAMES SFFREN TEPFN GSH 显著升高（p<0.01），且 MDA 水平接近 Control 组，SOD 和 GSH 水平高于其他剂量 组，表明高剂量 TFPF 可有效缓解肝脏氧化应激损伤。
A：丙二醛 MDA；B：谷胱甘肽过氧化物酶 GSH；C：总超氧化物歧化酶 SOD。与 Model
组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）；与 Control 组相比，#表
示差异显著（p<0.05），##表示差异极显著（p<0.01）。
图 2-7 银耳多糖复方对各组大鼠氧化应激指标的影响
Figure 2-7 Effect of TFPF compound on oxidative stress in rats in each group
2.7 组织形态学分析
如图 2-8 所示，Control 组肝脏呈红褐色、表面光滑、有弹性，无病变；Model 组部分肝 脏暗红或偏白灰，质地偏软，呈明显脂肪化。TFPFL 组肝脏颜色略灰，质地偏软，脂肪化 现象有所改善；其余组肝脏颜色接近 Control 组，脂肪化较 Model 组减轻，其中 Positive Control 100 aEer MA TEPYLN Ever GiNHf ggpro TIPELN TУP TFPEL 和 TFPFM 组形态最接近 Control 组，显示银耳多糖复方对酒精性脂肪肝具有一定缓解作用。
图 2-8 银耳多糖复方对 AFL 大鼠肝脏表观形态的影响
Figure 2-8 Effect of TFPF on the apparent morphology of AFL rat liver
H&E 染色（图 2-9）显示，Control 组肝组织结构完整、细胞排列有序；，Model 组 肝组织表现为肝细胞排列紊乱、脂肪空泡增多、中央静脉周围可见明显炎性细胞浸润，部分 肝细胞出现肿胀及空泡样变，提示存在脂肪变性及炎症损伤；经复方干预后，肝索结构逐渐 恢复，细胞排列趋于规则，炎性细胞浸润明显减少，中央静脉结构清晰。表明复方可能通过 改善肝脏脂质沉积及组织炎症损伤，从而缓解酒精性脂肪肝。
图 2-9 不同处理组的大鼠肝脏组织 H&E 染色切片
Figure 2-9 H&E stained sections of rat liver tissue in different treatment groups
2.8 肝脏代谢组学分析
2.8.1 主成分分析（PCA）
对肝脏进行非靶向代谢组学分析以揭示宿主代谢与药物干预的关系。PCA结果（图2-10）显示，在正、负离子模式下累计解释率分别为 21.6%和 30%。Model 组与 Control 组明显分离，表明模型构建成功；TFPFH 组与 Model 组亦呈现显著分离，提示两组代谢谱存在明显差异。同时，各组内样品聚集良好，说明组内肝脏代谢特征具有较好一致性。
图 2-10 POS＆NEG 模式的 PCA 分析
Figure 2-10 PCA analysis of positive and negative ion modes
注： A、B 分别为：POS 模式与 NEG 模式 Control、Model、TFPFH 比较组的 PCA 分
析；
2.8.2 正交-偏最小二乘判别分析（OPLS-DA） 如图 2-11 所示，POS 以及 NEG 模式的 OPLS-DA 分析图中，Control 与 Model 对比组、 TFPFH 与 Model 对比组均有着明显的分离，进一步说明银耳多糖复方对酒精性脂肪肝有显 著的影响，表明长期酒精的摄入及 TFPFH 干预可能逆转长期摄入酒精引起的部分代谢异常；
图 2-11 POS＆NEG 模式的 OPLS-DA 分析和排序检验图
Figure 2-11 OPLS-DA analysis and sorting test chart of positive and negative ion modes
注： A、B 分别代表 Control 与 Mode 对比的 POS、NEG 模式
C、D 分别代表 TFPFH 与 Mode 对比的 POS、NEG 模式
2.8.3 差异代谢物分析
在 OPLS-DA 分析中，以 VIP＞1.0、FC≤0.5 为筛选标准鉴定差异代谢物。共鉴定到 1186 个代谢物，其中 Model 组与 Control 组差异最为显著，存在 258 个差异代谢物；TFPFH 干预 后差异代谢物数量降至 233 个，提示其可部分逆转酒精诱导的代谢异常。如图 2-12 差异代 谢物火山图所示，Model 组与 Control 组相比，上调代谢物显著增多，差异显著（p<0.05）， 表明长期饮酒导致明显代谢紊乱；而 TFPFH 组与 Model 组比较显示上下调代谢物并存，且 多数达到显著水平，说明 TFPFH 对酒精引起的代谢失衡具有明显改善作用。
图 2-12 二级差异代谢物火山图
Figure 2-12 Volcanic map of secondary differential metabolites
注： A：Model 与 Control 比较组的火山图；B：TFPFH 与 Model 比较组的火山图；
基于 VIP 值筛选 TOP30 差异代谢物并绘制聚类热图（图 2-13）。结果显示，Control 组与 Model 组代谢物谱明显分离，提示长期饮酒显著扰乱机体代谢稳态。TFPFH 组进一步 形成独立聚类，部分在 Model 组中显著上调的代谢物在 TFPFH 干预后明显下调并趋近 Control 组，表明 TFPF 可在一定程度上逆转酒精诱导的代谢紊乱。具体而言，TFPF 干预显 著上调吲哚丙酮酸（Indolepyruvate）、田蓟苷（Tanakine）、根皮素（Phloretin）等代谢物 水平，同时下调溶血磷脂酰胆碱（LysoPC 20:4）和肉碱 3:0（CAR3:0）等代谢物。吲哚丙 酮酸（Indolepyruvate）TFPF 干预后 Indolepyruvate 水平显著升高，作为色氨酸代谢的重要 中间产物，其可通过激活 AhR 等相关信号抑制炎症反应[31]，进而 AhR 负向调控核心基因 JAK2/STAT3 介导的 JAK-STAT 通路，并影响 IL2 及 LCK 相关免疫炎症调控过程，从而减 轻炎症损伤[32]；田蓟苷（Tanakine）具有明确的抗炎和抗氧化活性，可降低 LPS 诱导的 NO、 IL-6 和 TNF-α水平并抑制氧化应激[33]，其在 TFPF 干预后显著上调，表明 TFPF 具有潜在 的抗炎和保肝作用；根皮素（Phloretin）作为典型类黄酮，Dierckx 等[34]研究表明，其可通 过 AMPK-依赖性自噬介导 Keap1 降解并激活 Nrf2 信号通路，从而发挥抗炎和抗氧化效应。 MAPK1 和 MAPK3（ERK1/2)是调控 ROS 生成和线粒体功能的核心节点，田蓟苷与根皮素 均具有良好的抗氧化能力，可通过清除活性氧（ROS）抑制核心基因 MAPK1 和 MAPK3 介 导的 MAPK 信号通路活化，从而降低氧化应激水平并减少炎症因子释放[25]。同时其还可激 活 PIK3CA/PIK3R1/AKT1 构成的 PI3K-AKT 通路，促进脂肪酸β-氧化并抑制脂质合成，改 善肝脏脂质沉积[35-36]。溶血磷脂酰胆碱（LysoPC 20:4）是一种重要的促炎介质，在病理状 中国知网 Val 态下可破坏细胞膜磷脂结构，促进免疫细胞迁移并激活炎症相关转录因子，从而诱发炎症反 应[37]，其在 TFPF 干预后显著下调，提示细胞膜磷脂水解及炎症脂质生成减少，这与 MAPK1/MAPK3 通路抑制密切相关，同时也反映 STAT3 介导的炎症信号减弱[38]；丙酰肉碱 （CAR 3:0）作为短链酰基肉碱，是线粒体脂肪酸氧化状态的重要代谢标志物。其本身并非 核受体组成型雄甾烷受体（CAR），但在 CAR 介导的细胞色素 P450 酶系（如 CYP2B）诱 导过程中，可增强外源性化合物的代谢并产生反应性中间代谢物，进而诱导氧化应激及线粒 体功能障碍；在线粒体脂肪酸β-氧化受阻的情况下，酰基肉碱外排增加，表现为丙酰肉碱 （CAR 3:0）等短链酰基肉碱水平升高[39]，TFPF 干预后其水平降低,脂肪酸转运、β-氧化及 能量代谢趋于正常，提示其可能通过调控 PIK3CA/AKT1 信号轴恢复能量代谢稳态[40]。
图 2-13 总体鉴定代谢物聚类热图
Figure 2-13 Overall identification metabolite cluster heat map
2.8.4 富集代谢通路
本研究将银耳多糖拆分为单糖单元进行分析，但该策略可能忽略多糖的高级结构特征对 其生物活性的影响，难以全面反映其真实的药效物质基础，因此，本研究结果更侧重于从代 谢通路相关角度解析对其潜在作用机制进行推测。通过 KEGG 通路富集分析（图 2-14）展 示了 Model、Control 及 TFPFH 组差异代谢物的通路特征。结果显示，酒精性脂肪肝主要影 Lricdi 30411211 CAR Oal 77 Equal 7-0-ghuகஸ்ட TRA-gh Moplonicis A K112 18. Na-Aocryl-1-ysine Timaki 33.Trimeth Qwd AIhyrnymande wid Haphes 响氨基酸代谢及脂质代谢途径，包括色氨酸代谢、丙氨酸–天冬氨酸–谷氨酸代谢、精氨酸 和脯氨酸代谢等，提示长期饮酒可引起这些通路的代谢紊乱。
酒精性脂肪肝的发病机制复杂，涉及脂质代谢紊乱、氨基酸代谢异常、氧化应激、炎症 反应等多个环节。在脂质代谢紊乱方面，酒精通过激活 SREBP-2 上调限速酶含量，增强肝 细胞内源性胆固醇合成[41]；同时乙醛抑制 CYP7A1 活性，阻断胆固醇向胆汁酸转化，导致 肝脏胆固醇蓄积。脂质堆积不仅引起甘油三酯、总胆固醇和 LDL 升高、HDL 下降，还可激 活 Kupffer 细胞，促进 TNF-α、IL-6 等炎症因子释放，显著加重肝脏炎症[42]。银耳多糖作为 一种抗炎活性成分，能下调脂质代谢相关基因（FAS）及炎症因子（TNF-α和 IL-6）的表达， 减轻甘油三酯堆积导致的肝损伤[43]。本研究中，TFPF 可显著降低血清 TC、LDL-C 水平， 升高 HDL-C 水平，通过肝脏切片发现干预后肝脏细胞得到修复，脂肪空泡明显减少，通路 富集结果显示甘油酯代谢发生重要变化，同时网络药理学筛选出的核心基因 PIK3CA、 PIK3R1、AKT1、和 SRC 介导的 PI3K-AKT 信号通路也能够调控脂质代谢稳态，抑制脂肪 生成并促进脂肪酸β-氧化[24]。提示 TFPF 可改善胆固醇代谢、甘油酯代谢紊乱，减少肝脏 胆固醇蓄积，从而减轻炎症反应。
氨基酸代谢紊乱是酒精性脂肪肝进展的重要驱动因素。丙氨酸和天冬氨酸代谢异常可导 致 ALT、AST 活性升高，扰乱糖异生和尿素循环，加重肝损伤；其中 AST/ALT＞2 是酒精 性肝炎的典型特征[44]。此外，谷氨酸代谢异常通过激活 Kupffer 细胞释放促炎因子（如 TNFα）诱发炎症，其产生的活性氧（ROS）则引发氧化应激，进而抑制谷氨酰胺合成酶的修复 功能[45]。银耳多糖、枳椇子、葛根、甘草、铁皮石斛均具有抗氧化、抗炎功能。银耳多糖 可降低体内 MDA 水平，同时提高 SOD、GSH 等抗氧化酶活性，减轻乙醇诱导的氧化损伤 [46]；铁皮石斛多糖可通过激活 Nrf2/HO-1/NQO1 信号通路缓解 D-Gal 诱导的氧化应激及炎症 反应[47]；葛根素能够通过上调酒精性脂肪肝小鼠肝脏 NLRP6 从而抑制 NF-κB 信号通路的激 活,发挥其保护作用[48]；肖成荣等[49]研究发现，枳椇子、葛根配伍解酒能显著回调 ALT、AST， 对急性酒精性肝损伤具有明显的保护作用。本研究结果表明，TFPF 干预后丙氨酸–天冬氨 酸–谷氨酸代谢通路关键代谢物（如 L-谷氨酰胺、2-Oxoglutarate）水平显著回升，肝脏 ALT、 AST 明显降低，肝脏 SOD、GSH 水平升高，MDA 含量下降。该通路的显著富集与网络药 理学预测结果一致，同时多酚类代谢物 Phloretin 和黄酮类物质 Tanakine 能够抑制核心基因 MAPK1 和 MAPK3 介导的 MAPK 通路，从而抑制两者参与氧化应激放大机制，减缓肝脏氧 化应激；吲哚丙酮酸能够负向调控 JAK2/STAT 可抑制肝细胞炎症因子释放，LCK 作为 T 细 胞受体（TCR）信号的关键酪氨酸激酶可恢复 T 细胞活性并促进 IL-2 产生[50]，IL-2 通过 JAK/STAT 信号参与免疫调控，从而降低炎症损伤[26]。提示 TFPF 通过稳定氨基酸代谢网络、 纠正能量代谢失衡并抑制炎症与氧化应激，从而有效减轻酒精诱导的肝细胞损伤。
色氨酸代谢紊乱是酒精性脂肪肝的关键诱因。酒精通过激活 IDO1 酶使色氨酸代谢偏向 犬尿氨酸通路，抑制具有抗氧化及节律调节作用的褪黑素（Melatonin）合成，肝脏作为循 环褪黑激素的主要积累和唯一代谢器官，其合成抑制加剧了氧化应激与能量代谢障碍[51-52]。 研究表明，姜黄素可抑制 IDO1 活性，阻断色氨酸向犬尿氨酸通路转化，从源头减轻肝脏炎 症，并通过调节肠道菌群促进色氨酸生成吲哚-3-乙酸（IAA）等衍生物，激活 AhR 通路增 强肠屏障，缓解肝损伤[53-54]。铁皮石斛可促进色氨酸向褪黑素转化，强化肝脏昼夜节律相关 的抗氧化防御，清除酒精代谢产生的 ROS，保护线粒体功能[55]。葛根素能通过优化肠道菌 群，促进色氨酸向吲哚-3-乙酸（IAA）等吲哚类衍生物转化[56]，并促进吲哚类衍生物激活 AhR，增强肠黏膜屏障，阻断 LPS 易位，从而抑制酒精诱导的肝脏炎症[57]。热图结果表明， 长期饮酒导致 Model 组色氨酸代谢通路异常，肝脏中 Melatonin 显著富集；经 TFPF 干预后 其水平明显下调，提示 TFPF 可抑制异常亢进的色氨酸代谢活性。同时，吲哚丙酮酸可作为 内源性配体前体激活 AhR 信号，从而在代谢与免疫调控之间发挥桥梁作用。其上调可通过 AhR 介 导 抑 制 JAK2/STAT3 信 号 轴 的 过 度 激 活 ， 减 少 炎 症 因 子 释 放 ， 同 时 抑 制 MAPK1/MAPK3 介导的 MAPK 通路活化，降低氧化应激水平。该通路的富集结果与网络药 理学预测一致，表明 TFPF 通过多通路协同调控重塑色氨酸代谢稳态，减轻肝脏炎症和氧化 应激，从而有效延缓 AFLD 进程。
图 2-14 Model、Control 及 TFPFH 组对比 KEGG 富集条形图
Figure 2-14 KEGG enrichment bar chart comparing the Model, Control, and TFPFH groups Aaineart Cemmal Trptoph Basal
3.结论
本研究结合网络药理学预测与代谢组学验证，系统阐明了 TFPF 缓解酒精性脂肪肝 （AFLD）的潜在机制。网络药理学结果显示，MAPK3、PIK3R1、MAPK1 等为关键靶点， 主要富集于色氨酸代谢、丙氨酸–天冬氨酸–谷氨酸代谢及 TNF 信号通路，涉及炎症反应、 氧化应激和氨基酸代谢调控。动物实验表明，TFPF 可显著降低肝脏氧化应激水平和胆固醇 含量，改善肝组织病理损伤并抑制炎症因子释放。代谢组学进一步筛选出吲哚丙酮酸、田蓟 苷、根皮素和褪黑素等关键差异代谢物，KEGG 分析提示色氨酸代谢及中心碳代谢在其保护 作用中具有重要意义。未来研究将进一步结合蛋白表达检测、信号通路阻断实验及分子对接 等方法，对关键靶点及通路进行系统验证，从而更全面地阐明其分子作用机制。
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